أعداد معمل لتشخيص الأمراض النباتية
يجب أن يكون موقع وتصميم المعمل بعيداً عن التيارات الهوائية وتكون نوافذه مصممة لتقليل التلوث الداخلي للمعمل وتكون أرضيته وجدرانه ناعمة ومصقولة ليسهل تطهير وتنظيف المعمل يومياً.
وعادة يلحق بالمعمل غرفة للعزل مزودة بالكهرباء والغاز ومصباح من الأشعة فوق البنفسجية. ويجب أن يتوفر أيضاً بالمعمل العديد من الأجهزة والأدوات والمواد الكيماوية والبيئات والحد الأدنى لها كما يلي:
أولاً الأجهزة:
مجاهر تشريحية ومجاهر مركبة، أوتوكلاف (جهاز تعقيم بالبخار
تحت ضغط، حضانات، ثلاجات (لحفظ العينات المرضية) أفران الهواء
الساخن (لتعقيم الأدوات والزجاجيات)، حمامات مائية، أجهزة لقياس الحموضةpH meters ، أجهزة الرج Shakers، أجهزة تقطير المياه، موازين Balances أجهزة طرد مركزي Centrifuges خلاط Waring blender.
أجـزاء المجهـر المـركـب
مصدر الإضاءة: يوجد عند قاعدة المجهر.
المسرح: يزود المسرح بماسك شرائح معدني يساعد على تحريك الشريحة (العينة المراد فحصها) في جميع الاتجاهات بسهولة.
المكثف: يثبت المكثف عند نقطة مناسبة لتجميع الضوء، وإضاءة العينة.
حجاب المكثف: يفتح الحجاب بالكامل بواسطة تحريك ذراع صغيرة توجد أسفل المسرح، ثم يتم غلق الحجاب تدريجياً حتى نصل إلي نقطة ما قبل انخفاض الضوء، وبذلك تكون أنسب فتحة للحجاب لتعطي أضل تمييز.
العدسات الشيئية: تعد العدسات الشيئية هي المسئولة عن التكبير والرؤية الواضحة، حيث تثبت العدسات الشيئية في قرص دائري يعرف بالقطعة الأنفية، وتكتب قوة التكبير على جانب كل عدسة شيئية.
العدسات العينية: تحتوي بعض المجاهر على عدسة عينة واحدة والبعض الأخر يحتوي على عدستين عينيتين ويجب ضبط المسافة بين العدسات العينية تبعاً للمسافة بين عينيك.
يكون التكبير الكلي للمجهر حاصل ضرب قوة تكبير العدسة الشيئية وقوة تكبير العدسة العينية (مثلاً عدسة شيئية 40 × وعدسة عينية 10 × يكون التكبير النهائي 400 × ).
الاستعمال السليم للمجهر:
- يحمل المجهر بواسطة اليدين.
- تنظيف المجهر:
تنظف العدسات بورق تنظيف العدسات مع استخدام الماء او محلول تنظيف العدسات، تنظف العدسة الزيتية بعد كل استعمال بواسطة قطعة من الشاش الجافة أو بورق تنظيف العدسات. تجنب وصول الزيت إلي العدسات غير الزيتية يفضل وضع غطاء واق من الغبار في حالة عدم استخدام المجهر. كما يجب إطفاء النور بمجرد الانتهاء من استعماله. حرك العينة على المسرح فإذا تحركت الأوساخ تكون الشريحة هي المتسخة. غير العدسات الشيئية فإذا اختفى الاتساخ تكون العدسة الشيئية السابقة هي المتسخة. أدر العدسة العينية فإذا دارت البقع المتسخة تكون العدسة العينية هي المتسخة.
- ضبط العدسات العينية لتلائم العينين.
- يتم ضبط الإضاءة.
- توضع الشريحة المراد فحصها على المسرح وتفحص بالعدسة الشيئة الصغرى حتى تصبح واضحة.
- يتم ضبط المكثف.
- يتم ضبط فتحة المكثف عند استخدام عدسات شيئية أكثر قوة.
ثانياً الأدوات:
أطباق بتري بلاستكية أو زجاجية معقمة، شرائح زجاجية وأغطية شرائح أنابيب اختبار وحوامل أنابيب اختبار، ماصات pipettes، كؤوس زجاجية، دوارق مخروطية، نواقيس زجاجية Bell jars أوعية لحفظ العينات Specimen jars، أدوات تشريح (ملاقط – ابر سهمية – أبر مستقيمة – ابر ذات العقدة – مقص) أقلام تعليم للكتابة على الزجاج والبلاستيك).
ثالثاً: مواد كيماوية تستخدم في التعقيم:
- محلول هيبوكلوريت الصوديوم (كلوركس تجاري):
ويستخدم محاول الكلوركس التجاري بتركيز 10% (10 مل كلوركس تجاري: 90 مل ماء معقم) في التعقيم السطحي للبنشات والتعقيم السطحي للأجزاء النباتية المصابة لعزل المسببات المرضية.
- كحول الإيثايل Ethyl alcohol :
يستخدم بتركيز 70% لتطهير الأيدي والعينات النباتية المصابة وتعقيم البنشات
- الفينول Phenol :
يستخدم بتركيز 2-5% للتعقيم السطحي لجدران وأرضيات المعمل ولحفظ العينات والنماذج المرضية.
رابعاً: الصبغات ومحاليل التحميل:
يجب صبغ (Staining) العينات حتى يمكن فحصها ميكروسكوبياً (معظم الفطريات ومقاطع الأنسجة النباتية) وأهم الصبغات الأكثر شيوعاً في معامل أمراض النبات.
- الصفرانيين Safranin: ميسيليوم والجراثيم الفطريات – خلايا بشرة النبات.
- أزرق القطن Cotton Blue: ميسيليوم وجراثيم الفطريات.
- محلول اللاكتوفينول: عبارة عن خليط من حامض اللاكتيك- الجلسرول – والماء والفينول وهو يعطي صورة جيدة اثناء الفحص المجهري ويضاف إليه أزرق القطن لأعطاء اللون للعينات الشفافة.
توضع نقطة من محلول التحميل (اللاكتوفينول) على شريحة مجهرية ثم توضع العينة (ميسيليوم أو جراثيم الفطر) وتستخدم ابرة تشريح لوضع العينة ثم ينزل غطاء الشريحة تدريجيا برفق وعناية لتقليل الفقاعات الهوائبة.
يمكن استخدام الشريط اللاصق Cellophane tape بتعريض الجانب اللاصق للمزرعة الفطرية مما يؤدي إلي التصاق الجراثيم ثم يوضع فوق نقطة محلول اللاكتوفينول وبذلك يعمل الشريط اللاصق عمل غطاء الشريحة.
خامساً : البيئات المغذية:
تعد اختيار البيئة المغذية من أهم العناصر لنجاح عملية عزل المسبب المرضي من الأنسجة النباتية أو من التربة، وعادة تستعمل بيئات مغذية صلبة حيث يضاف لها مادة الآجار وتتميز بأنها تصلب البيئة السائلة وتعطي سطحاً متماسكاً وبالتالي يسهل ملاحظة النموات الفطرية أو التراكيب الثمرية التي يكونها الفطر (تحتوي معظم البيئات على 20 جم من مادة الآجار لكل لتر من البيئة المغذية)، والبيئات المحتوية على مادة الآجار تنصهر عند درجة حرارة 95 مْ وتتجمد عند درجة حرارة 40 مْ، وتستخدم أطباق بتري التي تحتوي على البيئة المغذبة في عملية العزل حتى يسهل تعريف الفطريات الممرضة، وتنقل المزارع الفطرية بعد تنقيتها إلي انابيب الأجار المغذي المائلة لحفظها في الثلاجة على درجة حرارة 5 مْ.
توجد أنواع عديدة من البيئات المغذية فقد تكون من مستخلصات نباتية مثل بيئة آجار البطاطس والدكستروز (PDA) أو بيئات تركيبية معروفة التركيب الكيماوي مثل بيئة تشابك دوكس. وتوجد بيئات أخرى متخصصة لعزل الفطريات.
من الأنسجة النباتية أو من التربة مثل بيئة كومادو Komdo media لعزل الفطر فيوزاريوم Fusarium spp.
ويمكن تعريف الفطريات عن طريق الشكل المورفولوجي للمزرعة أو عن طريق وجود تراكيب ثمرية وعالباً تتميز البيئة الجيدة لعزل الفطريات بتشجيع النمو والتجرثم. وتعد بيئة آجار البطاطس والدكستروز (PDA) مناسبة وجيدة لعزل الفطريات وتعد من أكثر البيئات المستخدمة في معامل أمراض النبات
عزل المسببات المرضية الفطرية:
- طريقة وضع الأنسجة في أطباق البيئة:
- يتم غسل الأجزاء النباتية المتسخة بالماء الجاري (الجذور).
- يعقم البنش بقطعة صغيرة من القطن مبللة بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم (محلول الكلوركس 10%) أو بواسطة 75% من كحول ايثانول.
- يفتح الغاز وإشعال اللهب (موقد بنزن).
- تقطع البقع (العينة المرضية) مع قليل من النسج السليم حولها إلي قطع صغيرة تتراوح من 2-4 مم.
- توضع القطع الصغيرة (نصفها من النسيج المريض والنصف الأخر من النسيج السليم) في طبق بتري يحتوي على محلول كلوركس بتركيز 10% لمدة تتراوح من2-3 دقائق أو أكثر، ويتوف ذلك على نوع وعمر النسج النباتي بادرات صغيرة العمر أو نباتات كبيرة – نباتات حولية أو أشجار خشبية).
- يتم نقل القطع الصغيرة بواسطة ملقط معقم (يتم تعريض طرف الملقط فوق اللهب لدرجة الأحمرار ثم يغمس في كحول ايثانول 70% ثم يعرض للهب مرة اخرى) ثم تأخذ قطعة النسيج النباتي وتنقل إلي ورق ترشيح للتخلص من الزائد من محلول الكلوركس أو تنقل إلي طبق بتري يحتوى على ماء معقم ثم إلي ورق الترشيح.
- تنقل قطع النسيج النباتي من ورق الترشيح بعد التخلص من الزائد من محلول الكلوركس بواسطة ملقط معقم إلي أطباق بتري تحتوي على بيئة PDA حيث يوضع 4 قطع لكل طبق بتري وتكون كل قطعة بالقرب من حافة الطبق.
- تنقل الأطباق في الحضان على درجة حرارة 26-28 مْ وتوضع مقلوبة ويفضل وضعها داخل كيس بلاستيك أو لف الطبق بواسطة البارافيلم لمنع تلوثها بواسطة الحلم.
- الغرف الرطبة:
بعض الفطريات التي تصيب المجموع الخضري أو الأجزاء النباتية الموجودة فوق سطح التربة يمكن عزلها باستعمال الغرف الرطبة حيث تشجع الفطريات على التجرثم وهي طريقة سريعة لتعرف على المسبب المرضي في خلال من1-2 يوم.
- يوضع في طبق بتري معقم ورق ترشيح مقاس 9 سم ثم تضاف قليل من الماء المعقم تكفي لتبلل ورقة الترشيح.
- توضع الأجزاء النباتية في الطبق الذي يحتوي على ورق ترشيح مبلل وتحضن الأطباق على البنش أو الضوء لمدة 1-3 أيام.
- يتم فحص الجراثيم لتعرف على المسبب المرضي أو تلقط الجراثيم بواسطة إبرة معقمة وتضع في طبق يحتوي على بيئة آجار البطاطس والدكستروز وتحضن في الحضان لمدة من 5- 7 أيام ثم تفحص الجراثيم بواسطة المجهر الضوئي.
تعريف المسببات المرضية عن طريق استخدام التقنيات الحديثة:
توجد أجهزة وتقنيات حديثة مثل طريقةPCR وجهاز Biolog لتعريف مسببات الأمراض الفطرية وتسهل الكثير من الأجهزة الحديثة من سرعة تشخيص المرض النباتي حيث أصبحت هذه الأجهزة الحديثة واسعة الانتشار.
The Biolog Systems
تتطورت طريقة هذا النظام منذ عام 1980 وهذا النظام The Biolog Systems يمكن عن طريقه تعريف أكثر من 1900 نوع من البكتيريا والخمائر والفطريات ويوجد منه ثلاثة أنواع:
- Fully Automated systems
- Semi Automated systems
- Manually Read Systems
وتعتمد فكرة هذا النظام في تعريف الكائنات الحية الدقيقة (فطريات –
بكتيريا – خمائر) هي عندما يتوفر للكائن الحي مدى واسع من مصادر الكربون في طبق الخاص بالجهازMicro plate فأنه ينتج بعض الصفات المميزة نتيجة عمليات الأيض وتعرف ببصمة الأصبع الأيضية Fingerprint) Metabolic.). وفي السنوات القليلة الماضية حدث تطور سريع في بصمة الأصبع الأيضية حيث انه يمكن الحصول على نتائج التعريف خلال 4 ساعات أو أقل وتقرأ وتسجل في ثواني، حيث انها تقارن بقواعد المعلومات وذلك لتعريف النهائي.
ويستخدم هذا النظام في مجالات تطبيقية (الزراعة – أمراض النبات- المكافحة الحيوية – الأبحاث – معامل التحليل وغيرها).
مكونات النظام:
تشمل على حضان incubator، تحليل البياناتAnalyzer ، جهاز كمبيوتر Computer ، طباعةprinter ، سوفت وير Softwear لقراءة أطباق الجهاز Biolog-micro plate ، مقياس على شكل مخروط لتجهيز وأعداد اللقاح inocula ، لمبة مضيئة لتكبير المزرعة، ماصة الكترونية بها 8 قنوات، قاعدة معلومات Databases.
ويتطلب التعريف وجود مزرعة نقية من الكائن المراد تعريفه (فطر – بكتيريا – خمائر) في بيئة النمو الخاصة بالجهاز (Biolog Universal Growth media)، ويمكن التأكد من المزرعة النقية عن طريق استخدام اللمبة المضيئة المكبرة لملاحظة أي تغيرات في الشكل المورفولوجي للمزرعة في اللون او الحجم أو حافة المزرعة.
FF Microplate: أطباق صغيرة لتعريف الفطريات
تحتوي على 96 حفرة (بئر) Well منها 95 حفرة تحتوي مصادر كربون مختلفة مع حفرة للشاهد تحتوي على ماء، وترتبط مصادر الكربون مع ملح التترازلويم Tetrazolium salt. تخفف العينة النقية وتوضع في الحفرة ثم تحضن في الحضان ويتم تحليلها بعد التحضين. إذا استخدمت البكتيريا مصدر الكربون أثناء عمليات الأيض حيث يحدث أكسدة للمادة التفاعل ويختزل التترازوليم وبذلك يظهر اللون الأحمر نتيجة اختزال ملح التترازوليم
(2,3,5, triphenyle tetrazolium chloride —–► triphenyl formazan)
ويتم قراءة الطبق بنظام قاعدة المعلومات السابق تخزينها.
وعن طريق هذا النطام يمكن تعريف حوالي 250 الف نوع من الفطريات عن طريق استخدام اطباق FF Microplate مع Microlog software. وفي المستقبل سيحلق بقاعدة المعلومات اشكال الفطريات على بيئة Malt Extract Agar وبيئة Czapek Yeast Autoysate Agar مع صور فتوغرافية مجهرية للفطر.
طريقة استخدام FF Microplate : (شكل رقم 1)
- يتم تنمية المزرعة الفطرية على بيئة 2% (Malt extract Agar).
- يتم مسح وتجميع الجراثيم الكونيدية للفطر من على سطح البئية الصلبة، ويأخذ معلق الجراثيم بكثافة معينة Specified Density)) ويتم تلقيح الأطباق FF Microplate
- يضاف معلق الجراثيم بمعدل 100 ul في كل حفرة الموجودة في طبق FF Microplate
- تحضن أطباق FF Microplate في الحضان على درجة حرارة 26م ْ لمدة 24-96 ساعة.
- يتم قراءة الأطباق FF Microplate مستخدماً MicroStation Readear.